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流式細胞術檢測細胞周期和凋亡


流式細胞術檢測細胞周期:
細胞周期:指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期:有絲分裂發生,細胞分裂成兩個細胞,進入下一個細胞周期,或者進入靜止期(G0期),而G0期從DNA含量上無法與G1期區分,細胞開始RNA和蛋白質的合成,但DNA含量仍保持二倍體。S期:DNA開始合成,細胞核內DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期:當DNA復制成為4倍體時,細胞進入G2期。G2期細胞繼續合成RNA及蛋白質,直到進入M期。
PI法是經典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料,能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合,其結合的量與DNA的含量成正比例關系,用流式細胞儀進行分析,就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態,從而計算出各個期的百分含量。
實驗流程:
1  貼壁細胞:
1.1、細胞經過相應的培養刺激后,輕輕去除培養基,加入PBS輕輕搖晃去除PBS;
1.2、加入1ml胰酶,搖晃均勻后放入培養箱中消化(細胞不同消化時間不同);
1.3、消化結束后,將細胞從培養箱中取出,加入3ml含血清的培養基終止胰酶消化,使用移液器將細胞重懸轉移至離心管中;
1.4、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入3ml PBS重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入75%酒精重懸固定細胞,放入4℃冰箱中固定過夜;
1.5、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入PBS洗3次,加入PI染色液,37℃染色30min;
1.6、上流式細胞儀檢測。
2 懸浮細胞:
2.1、細胞經過相應的培養刺激后,將細胞和培養基全部轉移至離心管中,1000rpm常溫離心5min,去除上清;
2.2、加入3ml PBS重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清;
2.3、加入75%酒精重懸固定細胞,放入4℃冰箱中固定過夜;
2.4、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入PBS洗3次,加入PI染色液,37℃染色30min;
2.5、上流式細胞儀檢測。
 
細胞凋亡:細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發生在DNA片段化之前,因而檢測PS的表達,能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白,對PS有很高的親和性,并且可以與暴露于細胞外的PS相結合。利用這一原理,可以將AnnexinV標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差,因而只能標記壞死的細胞。
實驗流程:
1 貼壁細胞:
1.1、細胞經過相應的培養刺激后,將培養基分別轉移至離心管中,加入PBS輕輕搖晃去除PBS;
1.2、加入1ml胰酶,搖晃均勻后放入培養箱中消化(細胞不同消化時間不同,使用中不含EDTA胰酶);
1.3、消化結束后,將細胞從培養箱中取出,加入3ml含血清的培養基終止胰酶消化,使用移液器將細胞重懸轉移至含培養上清的離心管中;
1.4、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入3ml PBS重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入1&times;binding buffer重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清,重復該步驟一次;
1.5、100&mu;l 1&times;binding buffer重懸細胞,每個樣本加入5&mu;l AnnexinV和PI染色液,輕輕混勻后室溫避光孵育15min;
1.6、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入500&mu;l PBS重懸細胞,立刻上流式細胞儀檢測。
2 懸浮細胞:
2.1、細胞經過相應的培養刺激后,將細胞和培養基全部轉移至離心管中,1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入3ml PBS重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清;
2.2、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入3ml PBS重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入1&times;binding buffer重懸細胞,1000rpm常溫離心5min,去除上清,重復該步驟一次;
2.3、100&mu;l 1&times;binding buffer重懸細胞,每個樣本加入5&mu;l AnnexinV和PI染色液,輕輕混勻后室溫避光孵育15min;
2.4、1000rpm常溫離心5min,去除上清,加入500&mu;l PBS重懸細胞,立刻上流式細胞儀檢測。

圖 A 細胞周期檢測圖;B 細胞凋亡檢測圖

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